:: GEN EKSPRESYONU
GIRIS
Gen'den, proteine bilgi akisi degisik adimlari içermektedir. Bu adimlarda Sekil 6.1 ve Sekil 6.2 ve 6.3'de görülmektedir.
DNA'da saklanan kalitsal bilginin özgün yapi ve fonksiyonlari olan polipeptidlere dönüstürülmesi gereklidir. Ancak, DNA, bu is için tek basina bir baslangiç olusturamaz. Önce DNA'daki baz çiftlerinin dizileri, RNA'nin bilgi aktaran haberci moleküllerine geçirilir (Transkription). Bunlar sonra, gen ürünleri için bir baslangiç olustururlar (Translation). Son kertede olusan polipeptidlerin amino asit dizileri, DNA'daki kodon dizilerine karsilik gelmektedir.
Sekil 6.1. Protein sentezinde adimlar
Sekil 6.2. DNA, RNA ve protein arasindaki akis
Sekil 6.3. RNA-DNA Protein olusumu
6.1.A. Transcription:
Bu islem, DNA'daki nükleotid baz dizisinin, RNA'da karsit gelen diziye çevrilmesidir. Önce, DNA'nin bir iplikçigindeki nükleotid dizisi, ona karsit komplementer RNA molekülüne dönüstürülür (mRNA, haberci RNA). DNA heliksi açilir ve 3'Æ5' yönündeki DNA iplikçiligi, RNA'ya dönüsüm için bir baslangiç olusturur. RNA, 5'Æ3' yönünde sentezlenir. Translation için kullanilan RNA iplikçigi, kodlayan DNA iplikçiligi ile ayni oryantasyona sahiptir. Transkription, kompleks enzimler araciligi ile gerçeklesir.
Gen ekspresyonundaki ilk adim, bir DNA iplikçiligin, komplementer RNA'ya dönüsümü yani 'transcription'dur. Bir çok protein (Transkription faktörleri de denir) bir transkription kompleksi olusturur. Bu kompleks, DNA'ya baglanir. Transkription, RNA polimeraz ile katalize edilir. Ökaryotlardaki RNA polimerazlar kompleksdir, üç farkli enzim ihtiva ederler.
6.1.A.a. RNA polimeraz araciligi ile Transcription
Baslangiçta, RNA polimeraz, DNA çift sarmalina baglanir. Bu nokta da DNA açilmaya baslar ve RNA sentezi uzama ile baslar. Polimeraz DNA boyunca hareket ettikçe, mRNA olusur. Polimerazin hemen ardindan, DNA tekrar kapanmaya baslar. Sonunda, RNA polimeraz, DNA'dan uzaklastirilir. Bu noktada, duragan olmayan öncül transcriptin olusmasi tamamlanir. Duragan olmadigindan hemen modifikasyona ugrar.
Eukaryotlarin, üç RNA polimerazi vardir. Pol I, pol II, pol III. Bunlar üç farkli gen sinifini transcribe ederler. Düzenleyici diziler, oldukça kisa DNA dizilerinden olusurlar.Her dizi, bir spesifik protein için ki bunlar transkription faktörüdürler, bir baglanma noktasi olusturur.
Polymerase I ribozomal genlerden sorumludurlar.
Polymerase II polipeptidler ve bazi RNA'lardan
Polymerase III tRNA, 5S RNA, bazi küçük RNA'lardan sorumludurlar.
6.1.A.b. Polimeraz baglanma noktasi.
Bakterial RNA polimeraz, DNA'da yaklasik 60 bazlik spesifik bir bölgeye yapisir.
6.1.A.c. Transcription'un baslangici
Transcription, DNA'nin spesifik bir pozisyonundan baslar. Bu pozisyon, bir genin hemen baslangicinda (5' ucunda)'dir. Bu transcription baslangiç noktasi "promoter" olarak isimlendirilir. Promoter kisa bir DNA nükleotid dizisi olup; RNA polimeraza baglanarak, transkriptionun baslamasini düzenlemektedir. Transcription baslama noktasinin hemen üzerinde iki belirgin promotor bölgesi tanimlanabilir. Bu diziler, evrim boyunca çok iyi korunmuslardir (consensus seguences). Prokaryotlarda, alt bazlik (TATAAT) ve (TTGACA) seklinde diziler, genin baslangicindan 10 ve 35 bazlik mesafelerde yer alirlar. Bunlar "box" (kutu) olarak tanimlanirlar. Eukaryotlarda, bu promotor dizilerde farklilik bulunmaktadir.
6.1.A.d. Transkription üniti
Bir transkription üniti, transkriptionda kullanilan tüm DNA dizilerinin tümüdür. Promoter'de baslar ve terminatörde sonlanir. Promoter bölgesinde 5' ucuna "proximal", terminatör bölgede 3' ucunda "distal" terimleri kullanilir.
6.1.A.e. Transkriptionun baslangiç noktasinin belirlenmesi
Bir aktif genin belirlenmesi, transkriptionun baslangiç noktasinin belirlenmesidir. Bu olusum RNA ile DNA'nin karsilastirilmasi yapilabilir. Transcription sonrasinda, olusan RNA, tek iplikçikli DNA ile hidridizasyona tabi tutulur. Bir endonükleaz olan S1 nuclease, sadece tek iplikçikli DNA'yi degrade ettiginden, hibridize olan kisim korunur (RNA protection assay). RNA uzaklastirilir ve transcriptiona ugrayan DNA parçasi incelemeye tabi tutulur.
6.1.B. Eukaryotlarda Transkription Kontrolu
Eurokaryotlarda, bir gen tek bir polipeptidi kodlar ve öncül trans-kript, olgun haberci mRNA'ya dönüstürülür. Bu intron kirpilmasini ve öncül transkriptin modifikasyonunu kapsamaktadir.
A. Eukaryotik yapisal genlerin prototipi:
Yapisal bir gen, polipeptid gen ürünü kodlayan bir gendir. Transkription ve düzenleyici diziler olarak bölgelere ayrilabilir. Düzenleyici bölgeler, genin hem 5' hem de 3' bölgelerinde yer alirlar. Bunlara ek olarak, intronlarda da iç düzenleyici bölgeler bulunabilir. Bazi düzenleyici bölgeler, genin çok uzaginda da yer alabilirler.
B. Olgun eukaryotik mRNA prototipi:
Olgun eukaryotik mRNA, öncüsü RNA'dan intronlarin çikarilmasi; 5' ucuna 5' cap ve 3' ucuna sayisiz adenine nükleotidlerinin eklenmesiyle olusturur. Kodlamayan bir dizi, çevrim baslangiç isaretinin (AUG) hemen öncesinde yer alir. 3' ucunda çevrim dur isaretinin (UAA) hemen ardinda bir takipçi dizi bulunur. 5' cap ve polyadenylasyon'un eklenmesi enzimatik reaksiyonlari kapsamaktadir.
C. 7-Methyl-Guanosine Cap.
Eukaryotik hücrede, transcription hücre çekirdeginde, translasyon ise sitoplazmada olur. Eukaryotik mRNA'nin 5' ve 3' uçlari özel yapilara sahiptir. 5' ucundaki özel yapiya "cap" ismi verilir. Guanosine-7-methyl transferase etkisiyle, guanosine önclü mRNA'nin birinci ve ikinci riboz gruplarina triphosphate köprüsü ile baglanir (7 nolu pozisyondaki guanosin ve RNA zincirinin baslangicindaki iki baslangiç riboz) metile olur.
D. 3' ucunda polyadenylation.
Eukaryotik öncül kopyalar. AAAUAA kisa dizisinden hemen sonra spesifik bir endonükleaz ile bölünür. Ardindan, bu transcripte 100-250 adenine nükleotidi poly-A-polymerase araciligiyla baglanir (polyadenilasyon). Bu poly A ucu, proteine baglanir. Tüm mRNA'lar, histon proteinleri kodlayanlar disindakiler, poly-A- ucunu kodlarlar.
6.1.C. Transcription Faktörleri: DNA-baglayan Proteinler
Gen ekspresyonunun kontrolu, hücre fonksiyon ve yasami için önemlidir. Gen ekspresyonun kontrolu, DNA ile baglanan proteinler olan transkription faktörleri ile saglanir. Transcriptionu düzenleyen üç temel düzenleyici DNA motifi vardir.
1. Translation'un gerçek baslangicini olusturan diziler.
2. Translation'un terminasyonu düzenleyen diziler
3. Gen aktivasyonunda spesifik etkileri olan promoter yakinindaki DNA dizileri (repressorler, aktivatörler, enhancerler ve digerleri)
A. Transcription faktörlerinin genel etkileri
Polipeptidler ve bazi RNA'larin transcribe olmasi için gerekli olan RNA-polymeraz II aktivitesi, yeterli mRNA üretimi için yeterli degildir. RNA polymerase, tek basina degisik noktalarda, organize olmayan bir biçimde mRNA sentezini baslatir ve sentez hizi zayiftir. Hücre çekirdegi, aktive edici faktörlere yeterince sahiptir. Bu faktörlerden bazilarina trans-aktivating faktör denir.
B. DNA-baglayan proteinler
Proteinin, DNA baglayan bölgelerinde, proteinin iki komsu a-heliksleri stereokimyasal olarak düzenlenmistir. Öyleki bu helikslerden biri, DNA'nin major yarigindaki 6 bazla siki bir yapisma saglar (tanima noktasi). Diger heliks ise stabilize edici bölgeyi olusturur. Burada, amino asit dizisi degil, geometrik konfigurasyon kritikdir. Transkription faktörlerinden birisi promoter elemani olan "CCAAT" dizisine baglanan "CAT box"tipidir. Bunlar CAAT baglayan transcription faktörleri (CTF); CCAAT-baglayan proteinler (CBP); enhancer ve CBP-baglayan proteinler (E/CBP), nuclear factor I (NFI) ve digerleridir.
C. Çinko parmak motifi tasiyan transkription faktörleri
Bazi DNA-baglayan proteinler, çinko parmak adi verilen karakteristik yapilar tasimaktadir. Bir çinko atomu, iki cysteine ve iki histidine öylesine baglanir ki, yaklasik 10 amino asitlik parmak benzeri bir yapi olusur. Yani zincirleri DNA ile reaksiyona girebilir. Bazi transckription faktörleri, Sp1 faktörü-steroid reseptörleri, LDL-lipoprotein akseptör genleri, estrojen reseptörü ve digerleri zinc finger (çinko parmak) tasirlar. En azindan üç tip çinko parmak bulunmaktadir.
D. Leucine zipper
Bir leucine-zipper proteinde, bir DNA baglanma noktasi ve leucine-zipper bulunmaktadir. Bir leucine-zipper'in esas elemani, dört leucine'nin periodik olarak proteinin a-helical parçasinda tekrarlanmasidir. a-helikal bölgeler öylesine yapilanmistir ki, her leucine bir digerinden 7 degisik amino asitle ayrilmistir.Böylece her iki taraftaki 4 leucine bir fermuar gibi dizilir.
E. Steroid hormon baglanmasi ile aktivasyon
Transkriptional enhancerler transcription hizini arttiran düzenleyici DNA bölgeleridir. Yerleri ve aralarindaki mesafeler, transkriptionun baslama noktasina göre degiskenlik gösterir. Enchancer, hormon-reseptör kompleksine baglanarak aktive olur. Bu promoteri aktive eder ve transcription baslar (aktif gen). Memeli gelismesindeki bir çok önemli gen, steroidler ile regule edilir (Steroide duyarli transcription).
F. DNA'da protein-baglama bölge varligi degisik yöntemlerle analiz edilebilir.
1) Band shift (kayma) analizi: Proteine baglanan ve proteine baglanmayan DNA parçalarinin jel elektroforezi ile ayrimlanmasini saglar.
2) DNA footprinting: Proteine baglanan DNA bölgesinin, tek sarmal DNA'yi degrade eden enzime (DNAseI) karsi korunmasina dayanan bir teknikdir.
6.2. TRANSLATION
mRNA'daki, kodonlari olusturan nükleotid dizileri, translation sirasinda amino asitlere karsit gelen diziye dönüstürülür. Translation "baslangiç kodununda baslar. Amino asitler, transfer RNA ile siralanarak, dizi tanimlanir. Her amino asidin, kendi tRNA'si vardir. Bu mRNA'daki kodona komplementerdir (anti-kodon). Glycine için antikodon CCG olan tRNA, mRNA kodonda GGC ile karsitlanir. Bu noktada, sadece glycine yapisabilir. mRNA'daki 1, 2, 3, 4. üncü kodonlar, amino asid dizileri olarak siralanirlar. Kodon 1 her zaman AUG'dir (Baslangiç kodunu).
6.3. TRANSLATION EVRELERI
Translation (protein sentezi) hücre çekirdegi disinda, sitoplazmada ribozomlarda olusur. Ribozomlar, protein ve RNA moleküllerinden (rRNA) meydana gelir. Translation baslangicinda mRNA, ribosom ve tRNA kompleksi olusur. Bu olay IF1, IF2, IF3 vb. baslatici faktörlere ihtiyaç duyarlar.
Ikinci basamak elongation (uzama) evresidir. Bir sonraki kodon tarafindan belirlenen aminoasid, diziye eklenir. Üç fazli bir uzama siklusu gelisir. Kodon tanimasi, bir sonraki amino aside peptid baglanmasi ve 3' yönünde mRNA'ya ribozom üç nükleotidlerin hareketidir. mRNA, DUR kodonlarindan (UAA, UGA ve UAG) birisine ulasildiginda, translation, sona erer. Olusan polipeptid zinciri, ribozumu terk eder.
6.4. POSTTRANSLATIONAL PROCESSING
Proteinlerin büyük bir bölümü, translation sonrasi modifikasyona ugrarlar. Bu ilk translation ürünü aminoasit dizisi ile kendilerine özgü olan üç boyutlu yapisini alirlar.Iki veya daha fazla polipeptid zincirleri, tek bir proteini olusturmak üzere birlesebilirler. Örnegin iki alfa globin zinciri ile iki beta globin zinciri ile birleserek hemoglobin molekülünü olustururlar. Protein ürünleri kimyasal olarak da modifiye edilirler.
6.5. GEN EXPRESYONUNUN BELIRLENMESI YÖNTEMLERI
Gen ekspresyonunu belirleyecek klasik yöntemler hala önemlerini tasimaktadirlar. Bu yöntemler, bir spesifik genin ekspresyonunu belirleyecek biyokimyasal veya fenotipik degisiklikleri ortaya çikarir. Teknolojik ilerlemeler, spesifik bir genin ürününü veya protein molekülünü incelememizi mümkün kilmaktadir.
DNA Teknolojisinin gelismesiyle; herhangi bir genin transkripsiyonal ürününü analiz etmek ve belirlemek mümkündür. Spesifik RNA moleküllerini incelemek için; Insitu Hibridizasyon, Northern Blotting teknigi, Dot veya slot-blotting teknigi, S-1 Nuclease incelemesi, RNA'se protection incelemesi ve PCR gibi yöntemler kullanilabilir.
Gen ekspresyonunun kantitatif ölçümü için kullanilan Northern Blotting tekniginin daha duyarsiz olmasi, mikrogram düzeyinde RNA'ya gereksinme göstermesi gibi dezavantajlari bulundugundan, PCR teknigi ile Gen Ekspresyonunun Kantitatif ölçümü gelistirilmistir (Sekil 6.4).
Sekil 6.4. Gen ekspresyonunun PCR ile kalitatif ölçüm yönteminin sematik gösterimi
6.6. PROTEIN INCELEME YÖNTEMLERI
Proteinlerin invitro kosullarda incelenmesi genetik geçmisin aydinlatilmasinda, hastaliklarin patogenezinin ortaya çikarilmasinda, ilaç etkilesimlerinin belirlenmesinde kullanilmaktadir.
6.6.A. Protein Elektroforezi:
En basit teknik olup, proteini olusturan albumin, globin ve fraksionlarinin belirlenmesi ile hekime yardimci olabilir. Ayrica albumindeki genetik farkliliklari gösterebilir.
Bisalbuminemi, ender olarak görülen bir albumin sentezi bozuklugu olup, elektroforetik olarak albuminin iki bant biçiminde görülmesi ile tanimlanir. Çok ender olarak saptanabildiginden genetik isaret olarak nadiren kullanilir. Degisik insan topluluklarinda iki düzineyi askin albumin varyanti tanimlanmistir. Türkiye'de ilk bisalbuminemi olgusu Biyal ve ark. tarafindan yayinlanmistir. Daha sonra 1975'de Bingöl ve Aydin Mersin'li bir ailede hizli yürüyen bir bisalbuminemi olgusu belirlenmistir. Bu arastirmada Eti Türk'ü olan 450 kisi taranmis, bisalbuminemi olan ailede Hb S'in de beraber olmasi üzerinde durulmustur. 1978'de Yüregir ve ark. toplam 3738 kan örneginde 46 (%1.23) bisalbuminemi olgusu saptamislar, ayni çalismada Antakya'li mesane kanserli bir hastada yavas yürüyen bir albumin varyanti da belirlemislerdir. Franklin ve ark. bu varyantlarin albumin Naskapi ve albumin Adana olduklarini saptamislardir.
Bisalbuminemi sikliginin belirlenmesi amaciyla tarafimizdan arastirilan 515 saglikli bireyde yapilan protein elektroforezinde iki bireyde (%0.38) "bisalbuminemi" saptanmistir. Bu bisalbuminemi olgulari elektroforetik olarak hizli yürüyen varyantlar olup, her iki olgu da homozigot olarak belirlenmistir. Bu anomalinin yapilan ileri incelemelerle "Albumin Naskapi" ve "Albumin Patiala" ile idantik olduklarini belirlemistir. Bu olgularin elektroforetik görünümleri Sekil 6.5 ve Sekil 6.6'da görülmektedir.
Albumin Naskapi, daha önce Kuzey Amerika kizilderililerinde, Eti Türklerinde ve Hindistan'da saptanmistir. Albumin Patiala ise daha önce yalnizca Kuzey Hindistan'da belirlenmistir. Bunlarin yani sira Kibris Türklerinde rastladigimiz, ama birbirlerine idantik olarak albumin Adana ile albumin Kashmir'in Eti Türklerinde ve Kuzey Hindistan'da bulundugunu bu noktada eklemek gerekmektedir. Çünkü çok nadir olarak bulunabilen bu genlerin Hindistan ve Yakin Dogu Türklerinde bulunmasi Orta Asya'dan göç hipotezine uygunluk gösteren veriler olarak göze çarpmaktadir. Kaldi ki Hindistan'in Afganistan'in, Iran'in ve Anadolu'nun Mogol ve Türklerce istilasi ve gen akisina yol açmis olabilecekleri de tarihsel gerçeklerdir.
Albumin Naskapi'nin hem Kibris Türk'lerinde hem de Eti Türklerinde bulunmasi, bu genin 1570 Osmanli Fethinden sonra Anadolu'dan (Antalya, Mersin, Adana, Ankara) göç eden Türklerce adaya getirilmis oldugunu düsündürmektedir.
6.6.B. In Vitro Protein Sentezi:
Tüpde mRNA'dan yola çikarak, cDNA ve daha sonra Protein'in sentezine dayanmaktadir. Mutasyon analizinde hastaliklarin tanisinda kullanilmaktadir (Sekil 6. 7. ve 6. 8.).
Sekil 6.7. In vitro protein sentezi
Sekil 6.8. Non-poliposis kolon kanserinde in vitro protein analizi ile elde edilen sonuçlar (okla isaretli sira çift band tasiyor).
6.6.C. Iki Boyutlu Protein Elektroforezi:
Protein analizinde kullanilan bir elektroforez yöntemidir. Bilgisayarli ortamlarda protein analizini daha duyarli hale getirmektedir.
6.6.D. Protein Truncation Test:
Translasyon sonlanmasi olusturan mutasyonlarin analizinde kullanilan bir testtir. Duchenne Muscular Distrofide ilk kez kullanim alani bulmasina karsin, giderek artan sayida hastalikta (Ailevi adenomatöz polipozis, ataksi telanjiektazi, kistik fibrozis, fanconi anemisi, Hunter sendromu, neurofibromatosis tip 1 ve tip 2 vb.) kullanilmaya baslanmistir.
Yeni protein sentezi kullanilarak amplifie edilmis kopya'dan translasyon sonlanmasi olusturan mutasyonlarin varligi belirlenir (Sekil 6.9). PTT, üç önemli asamadan geçer.
1) Genomik DNA'nin elde edilmesi ve hedef bölgenin PCR ile amplifikasyonu veya RNA izolasyonu ile RT-PCR ile hedef bölgenin amplifikasyonu.
2) PCR ürünün, in vitro olarak RNA sentezi için kullanilmasi ve sonra proteine çevrilmesi.
3) Sentezlenen proteinin Poly Akrilamid Jel elektroforezinde incelenmesi.
Primer tasarimi çok önemlidir. ATG baslatma kodunu, mutlaka kodlayan diziyle esgüdümlü olmalidir.
Sentez sirasinda S35 Methionine, S35 cysteine veya H3 leucine kullanilir. Non-radioaktif tanimlama yöntemleri de kullanilabilir.
Sekil 6.9. Protein Truncation Testi'nin sematik görünümü.
6.6.E. Western Blotting Yöntemi
Dr. Pelin Adiyaman
Bu yöntem ilk kez 1979'da Towbin ve arkadaslari, 1981'de de Burnette tarafindan yayinlandi. Diger arastirmacilar bunu takip eden yillarda bu yöntemi çesitli proteinlerin gösteriminde kullandilar.
Western blotting yönteminin esasi; proteinlerin poliakrilamid jelde elektroforez ile ayrilmasi ve ayrilan proteinlerin otoradyografi, ultraviyole isigi ya da peroksidaz reaksiyon ürünü ile gösterimine dayanir. 100pg kadar küçük miktarlardaki proteinlerin bile varligi kesin olarak gösterilebilir. Bu nedenle yöntem çok genis bir yelpazedeki proteinlerin spesifik reaksiyonlarini ve baglanma özelliklerini göstermede kullanilmaktadir. Günümüze kadar western blotting yöntemi çok çesitli alanlarda kullanilmistir. Insulin benzeri büyüme faktörü baglayici proteinlerinin (IGFBP) gösterilmesinde, normal ve kanser hücrelerinin sinyal mekanizmalarinin anlasilmasinda kullanildigi gibi mikrobiyolojik, immünolojik arastirmalarda da bu metoddan yararlanilmistir. Literatürde western blotting analizi; Treponema pallidum'un spesifik antijenlerine karsi olusan Ig M'lerin tayini ile konjenital sifiliz tanisinin konulmasinda, human T-cell lymphotropic virus type 1, type 2 (HTLV-1, HTLV-2) enfeksiyonlarinda virusun serolojik tayininde, staf koagülaz (-) stafilokoklarin (özellikle de S.epidermidis ve S. saprophyticus türlerinin) hücresel antijenik özelliklerinin belirlenmesinde; meme kanserli olgularda prognoz ayiriminda kullanilmistir.
Western blotting yapiminda gösterilmesi amaçlanan proteinin özelligine göre poliakrilamid jelden transfer çok çesitli kati maddeler üzerine yapildigi gibi isaretlemede farkli ajanlar da kullanilmistir. Renart 1979'da diazobenziloksimetil (DBM), Seed 1982'de diazofeniltiyo kagidi (DPT), 1980'de Hitzeman siyanojen-bromidle aktive filtre kagidi ve çesitli arastirmacilar siyanürik klorid kagit ve aktive naylon membrani yine bu amaçla kullandilar. Bu yöntemler çok güvenilir olmalarina karsin hazirlanmalari ve yapimlari çok güç oldugundan yerlerini Burnette ve arkadaslarinin önermis oldugu nitrosellüloz membrana birakmislardir.
Yapimi:
Jel elekroforezine baslamadan önce örnekler örnek tamponu ile 1/100 oraninda sulandirilir, 3 dakika 100 °C'de isitilarak denatüre edilir.
Jellerin hazirlanmasi:
Jel elektroforezi yapilirken iki tip jel kullanilir. Birikim jelinde denature olan polipeptidler sodyum dodesil sülfata (SDS) baglanir, bu baglanmanin miktari polipeptidin moleküler agirligi ile orantili oldugundan jel üzerindeki yürüme hizi da bu agirliga göre degisir. Örnekler birikim jelindenden geçerken molekül agirliklarina göre polipeptid gruplarini olustururlar. Moleküler agirligi bilinen örnekler koyularak çalisilan örneklerin moleküler agirliklari belirlenir. Ayirici jelde polipeptid gruplari birbirinden ayrilir.
Jel Sandiviçinin Kurulmasi:
• Biri kisa digeri uzun iki cam plak aralarina aralik açicilar konularak üst üste yerlestirilir. Sandiviçin kenarlari tutucular ile sabitlestirildikten sonra sandiviç ayaklara oturtulur.
• Sandiviçin içine ayirici jel konularak üzerine isosorbitol dikkatlice eklenir. Isosorbitol jel yüzeyinin düzgün olmasini saglarken oksijenin jel içine girerek polimerizasyonu engellemesini önler.
• Jel oda isisinda dondurulduktan sonra yikanarak isosorbitol temizlenir.
• Jelin üzerinde bulunan bosluk içine, örneklerin koyulacagi aralari olusturmak amaci ile jel taragi yerlestirilir.
• Birikim jeli ayirici jelin üzerine eklenir (Sekil 6.10).
Sekil 6.10. Jel Sandiviçinin ve taragin koyularak örnek araliklarinin olusturulmasi
• Jellerin üzeri parafin yapragi ile kapatilarak donmalari için bekletilir.
• Jeller donduktan sonra örnek bosluklarinin olusmasini saglamak amaci ile tarak çikarilir.
• Sandiviç ayaklardan alinarak genel sogutucu içine yerlestirilir.
• Genel sogutucu içindeki bosluklar elektrod tampon solusyonu ile doldurulur.
• Hazirlanmis olan örnekler, örnek bosluklarina; her bosluga bir örnek gelecek sekilde eklenir ve voltaj 8V/cm.jel (yaklasik 2.5 cm'lik jele 20V) olacak sekilde ayarlanir.
• Örnekler ayirici jele geçtiginde voltaj 15 V/cm.jel'e ayarlanir.
• Tüm örnekler jelin altina indiginde elektroforez islemi sonlandirilir.
• Jeller camlardan ayirilarak western tampon solusyonu ile çalkalanir.
• Özel western delikli transfer sandviçi içine sirayla sünger, filtre kagidi, jel, nitrosellüloz membran, filtre kagidi, sünger olacak sekilde koyularak sandiviç kapatilir (Sekil 6.11).
Sekil 6.11. Western blot özel delikli sandviç.
• Bu asamada iki ayri metod uygulanabilir. Ilk yöntemde sandiviç özel kap içine yerlestirilerek kap western tamponu ile doldurulup, soguk odada 12-20 saat süreyle 50V'ta bekletilir. Sogukta bekletilmenin nedeni jelin asiri isinmasinin engellenmesidir. Ikinci yöntemde ise 1.5-2 saat oda isisinda 0.65 mA/cm2.jel uygulanarak bekletilir (Sekil 6.12). Her iki yöntemde de sonuç basarilidir.
Sekil 6.12. Sandviç özel kap içinde membran ve jel karsi karsiya gelecek sekilde konularak bekletilir.
• Sandiviç açilarak membran ayirilir ve önce TBS+nonidet P-40 içinde sonra TBS+BSA ile son olarak da TBS+ Tween-20 içinde çalkalanarak yikanir. Bloklanan membran I125'le isaretli protein ortama eklenerek 20-24 saat çalkalanarak yikanir. (Bu tespit islemi sirasinda radyoaktif I125'le isaretlenmis protein A veya antikor, horseradish peroksidaz ile isleme sokulmus protein A kullanilir. Proteinler nitrosellüloz membranda India ink veya Ponceau S ile boyanabilir. Isaretleme için radyoaktif madde kullanilmayacaksa Coomassie Brilliant Blue kullanilabilir.)
• Isaretlenmis membran asilarak kurutulur.
• Radyoaktif madde kullanildiginda membran kuruduktan sonra otoradiyografi kaseti, Kodak X-Omat AR film kutusu alinarak karanlik odada membran film üzerine koyularak kaset içerisine yerlestirilir.
• Kaset kapatilarak kursun zarf içerisinde derin dondurucuda 48 saat bekletilir.
• Derin dondurucudan çikarildiktan sonra isinan film banyo yapilir (Sekil 6.13 ve 6.14).
Sekil 6.13.
Sekil 6.14.
KAYNAKÇA
Akar N, Cin S, Çavdar AO, Arcasoy A. Kibris Türklerinde Bisalbuminemi Sikligi. Doga 1986: 10: 1-4.
Bingöl, G., Ayanoglu, G., Albumin Mersin: Yeni bir Albumin Varyanti, TÜBITAK V. Bilim Kongresi, Tip Arastirma Grubu Tebligleri, Istanbul, TÜBITAK Yayinlari, 371, Ankara, 1977.
Biyal, F., Hatemi, V., Öker, C., Double Albuminemia: A Rare Genetic Abnormality, New Ist. Cont. Clin. Scie., 8, 102, 1965.
Burnette WN. Western blotting : electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.Anal Biochem,112(2):195-203 1981 Apr.
Davies KE. Human Genetic Disease Analysis: A practical approach. IRL Press,1993.
Erlich HA. PCR Technology., Stockton Press, 1989
Franklin, SG, Wolf, SI, Özdemir, Y. Albumin Naskapi Variant in North American Indians and Eti Turks, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 9, 5480, 1980.
Guy GR; Philip R; Tan YH. Analysis of cellular phosphoproteins by two-dimensional gel elctrophoresis: applications for cell signalling in normal and cancer cells. Electrophoresis, 1994 Mar, 15:3-4, 417-40.
Harvey B, Sweet A. High efficiency transcription - translation. Life Science 1995: 17: 5-8.
Hogervorst FBL. The protein Truncation Test. Promega Notes 1997; 62: 7-10.
Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. PCR Protocols.Academic Press,1990.
Kaur, Franklin, S.G., Shrivastava, P.K., et al., Alloalbuminemia in North India, Am. J. Hum Genet., 34, 6, 972-9, 1982.
Lin W; Kasamatsu H. On the electrotransfer of polypeptides from gels to nitrocellulose membranes. Anal. Biochem, 128(2):302-11 1983 Feb 1
McPherson MJ, Quirke P, Taylor GR.PCR: A Practical Approach. IRL Press,1991
Melartin, L., Blumberg, B.S., Albumin Naskapi: A New Variant of Albumin Science, 153, 1664, 1966.
Meyer MP; Eddy T; Baughn RE. Analysis of western blotting (immunoblotting) tecnique in diagnosis of congenital syphilis. J. Clin. Microbiol, 1994 Mar, 32:3, 629-33.
Promega, Protocols and Applications Guide, Promega Corporation.Second Ed.,1991.
Ravdin PM; Tandon AK; Allred DC; Clark GM; Fuqua SA; Hilsenbeck SH; Chamness GC; Osborne CK. Cathepsin D by western blotting and immunohistochemistry: failure to confirm correlations with prognosis in node-negative breast cancer. J. Clin. Oncol, 1994 Mar, 12:3, 467-74.
Rolfs A, Schuller I, Finckh U, Weber-Rolfs I. PCR: Clinical Diagnostics and Research. Springer-Verlag, 1992
Rosenthal N, Regulation of gene Expression. New Eng J Med, 1994, 331,931-933.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Sambrook J; Fritsch EF; Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Thompson MW, McInnes RR, Willard HF., Genetics in Medicine, 5th.Ed. WB Saunders Company, 1991.
Towbin H; Staehelin T; Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(9):4350-4 1979 Sep.
Tyski S; Celej A; Gut W; Hryniewicz W. Use of western blotting technique and computer analysis for comparing cellular antigens of coagulase- negative staphylococci. Med. Dosw Mikrobiol, 1994, 46:3, 133-44.
Varma M; Rudolph DL; Knuchel M; Switzer WM; Hadlock KG; Velligan M; Chan L; Foung SK; Lal RB. Enhanced specificity of truncated transmembrane protein for serologic confirmation of human T_cell lymphotrophic virus type 1 (HTLV-1) and HTLV-2 infections by western blot (immunoblot) assay containing recombinant envelope glycoproteins. J. Clin Microbiol, 1995 Dec, 33:12, 3239-44.
Watson JD,Gilman M, Witkowski J, Zoller M. Recombinant DNA. Second Edition, Scientific American Books, 1992.
White BA, PCR PROTOCOLS., Humana Press, Totawa, New Jersey.1993.
Yüregir, G.T., Akay, A.K., Bisalbumin ve Hemoglobin S'in Çukurova Bölgesinde Yöresel Dagilimi, TÜBITAK VII. Bilim Kongresi Top Arastirma Grubu Teblig Özetleri, Hematoloji Seksiyonu, 29 Eylül-3 Ekim 1980, ankara, TÜBITAK Yayinlari, 461, Ankara, 1980.
|
